مقدمة:
الهيماتوكسيلين والأيوزين هو الملون الأكثر انتشارا" في التلوين التشريحي المجهري. وإن شعبيته الكبيرة مبنية على بساطته مقارنتا" بغيره وعلى قدرته على إظهار بوضوح عدد هائل من البنى النسيجية المختلفة. الهيماتوكسيلين يمكن تحضيره بطرق متعددة ويمتلك قابلية تطبيق على النسج من مواقع مختلفة. مبدئيا" , الهيماتوكسيلين يلون نواة الخلية بالأزرق\الأسود, مع تفاصيل داخل نووية واضحة. بينما يلون الأيوزين السيتوبلاسما الخلوية ومعظم ألياف النسيج الضام بكثافات وتدرجات متنوعة من الزهري, البرتقالي والأحمر. على أي حال , الهيماتوكسيلين لوحده له استعمالات أكثر بكثير من المزيج هيماتوكسيلين أيوزين.
الهيماتوكسيلين:
يستخرج من لب شجرة هيماتوكسيلين كامبشيانوم التي يعود أصلها لولاية كامبش المكسيكية ولكنه الآن يزرع بشكل أساسي في جزر الهند الغربية. يستخرج الهيماتوكسيلين من الخشب بالماء الساخن
ومن ثم يستخلص من المعلق المائي باستعمال البولة. الهيماتوكسيلين بحد ذاته ليس ملونا". معظم منتجات الأكسدة هي الهيماتين, وهو صباغ طبيعي مسؤول عن خصائص اللون.
الهيماتين يمكن أن ينتج عن الهيماتوكسيلين بطريقتين:
الأكسدة الطبيعية من خلال التعرض للضوء والهواء. وهي عملية بطيئة أحيانا" تأخذ حتى 3-4 أشهر ,ولكن المحلول الناتج يبدو أنه يحتفظ بقدرته التلوينية لوقت طويل . المحلول الذي حضره كل من إيرلخ وديلافيلد كل على حدا هو مثال على الهيماتوكسيلين المحضر طبيعيا".
الأكسدة الكيميائية باستعمال يود الصوديوم (محلول ماير) أو أوكسيد الزئبق (محلول هاريس) .
استعمال عوامل الأكسدة الكيميائية يحول الهيماتوكسيلين إلى هيماتين لحظيا" تقريبا" . لهذا يكون يكون المحلول جاهزا" للإستعمال مباشرة بعد التحضير . بشكل عام إنها تمتلك زمن استعمال قصير مقارنة بالهيماتوكسيلين المؤكسد طبيعيا" ربما لأن عملية الأكسدة المستمرة في الضوء والهواء تدمر في النهاية معظم الهيماتين, محولة إياه إلى مركب عديم اللون .
الهيماتين سالب الشحنة ,مما يعطيه ألفة ضعيفة تجاه النسج, وهو غير مناسب كملون للنواة دون وجود مثبت للون .
أكثر المثبتات الملائمة للهيماتوكسيلين هي أملاح الألمنيوم ,الحديد ,و التنغستين. محاليل الهيماتوكسيلين التي تستعمل الرصاص كمثبت نادرة الإستعمال.
المثبت\المعدن يمنح شحنة صافية إيجابية للمعقد صبغة-مثبت مما يمكنه من الإرتباط بالمواقع النسيجية سالبة الشحنة مثل الكروماتين النووي.إن نوع المثبت المستعمل يؤثر بشدة على نوع المكونات النسيجية الملونة وعلى لونها النهائي.
أغلب المثبتات غير مشتركة ضمن محاليل الهيماتوكسيلين, ومع ذلك محاليل هيماتوكسيلين معينة تستلزم أن يعامل المقطع النسيجي بالمثبت قبل التلوين: مثل محضر هايدنهاين مع الحديد.
محاليل الهيماتوكسيلين يمكن تصنيفها تبعا" للمثبت المستخدم:
هيماتوكسياين ألمنيوم, هيماتوكسيلين حديد, هيماتوكسيلين تنغستين, هيماتوكسيلين موليبيدينيوم, هيماتوكسيلين رصاص, هيماتوكسيلين بدون مثبت.
أولا" : مجموعة الهيماتوكسيلين ألمنيوم:
تضم أغلب المحاليل المستعملة بشكل روتيني والمثبت المستخدم هو عادة كبريتات بوتاسيم ألمنيوم أو كبريتات أمونيوم ألمنيوم. وهي تصبغ النواة بلون أحمر يتحول إلى اللون الأزرق الأسود المألوف عندما تغسل الشريحة بمحلول قلوي ضعيف وهذه العملية تعرف بالتزريق. هناك طريقتين للتطبيق : تراجعيا" بمعنى أن الشريحة تصبغ بشكل مفرط ثم توضع في الكحول الحمضي من أجل التفريق ثم يتبع ذلك عملية التزريق.
تقدميا"تصبغ الشريحة لزمن محدد مسبقا" بحيث يتم صبغ النواة بشكل ملائم تماما" دون الخلفية النسيجية التي تبقى نسبيا" غير مصبوغة. إن الزمن المناسب للحصول على لون مرضي التفريق يختلف تبعا" لنوع وعمر المحلول المحضر, نوع النسيج , والتفضيل الشخصي للمشرح المرضي.
محلول إيرليخ 1886:
هو محلول هيم-ألم ينتج طبيعيا" ويحتاج لشهر حتى ينضج. لكن يمكن تسريع النضوج بوضع الزجاجة في مكان دافئ ومشمس مثل حافة النافذة. وهذا أسرع صيفا" منه شتاء". إنه ملون ممتاز للنواة, كما أنه يصبغ المخاط بما فيه متعددات السكاكر المخاطية في الغضروف أي ينصح به لصبغ مقاطع العظام والغضاريف.
تحضيره: هيماتوكسيلين 2غ – كحول مطلق 100 مل - غليسرين 100مل – ماء مقطر100مل – بوتاسيوم ألمنيوم 15غ تقريبا" – حمض الخل الثلجي 10مل .
يحل الهيماتوكسيلين في الكحول وتضاف المواد الأخرى. يضاف الغليسرين لإبطاء عملية الأكسدة ولإطالة زمن التخزين. النضج الطبيعي في ضوء الشمس يستغرق شهرين , لكن في حال العجلة يمكن إضافة يود الصوديوم 50 مغ لكل 1غ هيماتوكسيلين لحصول على نضج كيميائي , ولكن هذا سيقلل بشكل ملحوظ من عمر تخزين المحلول. وبالتعريف هذا المحلول المؤكسد كيميائيا" ليس محضر إيرليخ الحقيقي ولن يمتلك استمرارية هيماتوكسيلين إيرليخ. دائما" ينصح بالفلترة قبل الإستعمال.
محلول ماير1903:
هو محلول هيم-ألم ينضج كيميائيا"مع يود الصوديوم. يمكن استعماله تراجعيا" مثل محاليل هيم-ألم الأخرى, ومع ذلك هو نافع أيضا" بالطريقة التقدمية خاصة في الحالات التي تحتاج إلى ملون نووي للعد لتسليط الضوء على أحد المكونات السيتوبلاسمية التي تم إظهارها بملون خاص , وحيث يكون التفريق بالكحول الحمضي مدمرا" أو نازعا" للون من المكون السيتوبلاسمي المعني.
الملون يطبق لزمن قصير عادة 5-10 دقائق, حتى تصبغ النواة , ثم يتم التزريق دون أي تفريق.
تحضيره:هيماتوكسيلين 1غ – ماء مقطر 1000مل – بوتاسيوم أو أمونيوم ألمنيوم 50غ – يود
50 غ(SLR) الصوديوم 0.2غ – حمض الليمون 1غ – كلورال هيدرات
) 30غ.الهيماتوكسيلين, البوتاسيوم ألمنيوم و يود الصوديوم تحل في الماء AR أو كلورال هيدرات(
المقطر مع التسخين والتحريك, أو تترك في درجة حرارة الغرفة طوال الليل. يضاف الكلورال هيدرات وحمض الليمون, ويغلى المزيج لمدة 5 دقائق ثم تبرد وتفلتر. يمكن تخفيض كمية الكلورال ).ويكون المزيج جاهزا" للإستعمال حالا".AR هيدرات إذا استعملت نوعية أكثر نقاء"(
محلول هاريس1900:
هو محلول هيم-ألم تقليديا" ينضج كيميائيا"باستعمال أوكسيد الزئيق. وبما أنه يعتبر عالي السمية , غير صديق للبيئة , ويمكن أن يسبب تغيرات على المدى الطويل غير قابلة للعودة على آلات الصبغ الآلية, تم استبداله بيود الصوديوم أو البوتاسيوم كمؤكسد.
يعتبر مفيدا" للاستخدامات العامة وهو يصبغ النواة خاصة بشكل صاف, ولهذا السبب فقد استعمل , كملون تقدمي ,في علم انتزاع النواة تشخيصيا".
تحضيره: هيماتوكسيلين 2.5غ – كحول مطلق 25مل – بوتاسيوم ألمنيوم 50غ – ماء مقطر 500مل – أوكسيد الزئبق1.25غ أويود الصوديوم0.5غ – حمض الخل الثلجي 20مل.
يحل الهيماتوكسيلين في الكحول المطلق , ثم يضاف إلى الألمنيوم الذي تم حله مسبقا" في الماء المقطر الدافئ في 2ليتر.يغلى المزيج بسرعة وثم يضاف ببطء وبحرص أوكسيد الزئبق أو يود الصوديوم. يبرد المحلول بسرعة بوضعه في الماء البارد أو رقائق الثلج. فلي
عندما يبرد المحلول , يضاف حمض الخل ويصبح المحلول جاهزا" للإستعمال الفوري.
محلول كول1943:
هو محلول هيم- ألم ينضج كيميائيا" باستعمال محلول الكحول اليودي.
تحضيره: هيماتوكسيلين 1.5غ – بوتاسيم ألمنيوم المائي المشبع 700مل – 1%يود في 95%كحول 50مل – ماء مقطر 250مل .
يحل الهيماتوكسيلين في الماء المقطر الدافئ ويمزج مع محلول اليود . يضاف محلول الألمنيوم , ويغلى المزيج , ثم يبرد بسرعة ويفلتر . المحلول أصبح جاهزا" للإستعمال المباشر , وقد يحتاج إلى
فلترة بعد التخزين .
محلول جيل1974:
تحضيره: هيماتوكسيلين2غ – يود الصوديوم 0.2غ – كبريتات الألمنيوم 17.6غ - ماء مقطر750مل – إيثانول250 مل – حمض الخل الثلجي20مل. يمزج الماء المقطر مع الإيثانول, ثم يحل الهيماتوكسيلين . ثم تحل كبريتات الألمنيوم , أخيرا" يضاف حمض الخل الثلجي ويحرك لمدة ساعة . يفلتر المحلول قبل الإستعمال .
الإيوزين:
هو الملون الأكثر ملائمة للمشاركة مع الهيماتوكسيلين ألمنيوم لإظهار البنية النسيجية العامة. قيمته الخاصة تكمن في قدرته , مع التفريق الملائم , على إظهار الفرق بين السيتوبلاسم للأنواع الخلوية المختلفة, وبين الأنواع المختلفة لألياف والمادة الأساسية للنسيج الضام , وذلك عبر صبغهم بظلال مختلفة من الأحمر والزهري .
الأيوزينات هي عبارة عن أصبغة كزانتين ويمكن الحصول على أنواع مختلفة منه تجاريا":
(أيوزين مصفر, أيوزين حلول بالماء) , (إيثيل أيوزين, أيوزين حلول بالكحول) ,(أيوزين مزرق ,إريثروزين ب).
من بين هذه الأنواع , الأيوزين المصفر هو الأكثر إنتشارا" وحلوليته في الكحول مقبولة ,لذلك يباع أحيانا" على أنه "حلول في الماء والكحول" .
كملون سيتوبلاسمي , يستعمل عادة كالتالي: 0.5% أو 1% محلولا" في الماء المقطر , مع إضافة بلورات التيمول لمنع نمو الفطور. يقال أن إضافة بعض حمض الخل (0.5 مل لكل 1000 مل صباغ) يزيد من حدة اللون.
التفريق يحصل عند الغسل بماء الصنبور الجاري , وبعض من التفريق يحصل عند نزع الماء بالكحولات . كثافة اللون الحاصل ودرجة التفريق المطلوبة , تعتمد إلى حد بعيد على الذوق الفردي.
إيثيل أيوزين و الأيوزين المزرق هما حاليا" نادرا الإستعمال.
مراحل التلوين القياسي بالهيماتوكسيلين والأيوزين عند التثبيت بالبارافين:
1. نزع الشمع من الشرائح, الإماهة بالكحولات المتدرجة حتى الماء.
2. إزالة أصبغة التثبيت.
3. التلوين بمحلول هيماتوكسيلين ألمنيوم المرغوب بالمدة المناسبة .
4. نغسل جيدا" بمياه الصنبور الجارية لمدة لا تتجاوز الخمس دقائق.
5. التفريق باستعمال 1% كحول حمضي (1% حمض كلور الماء 70% كحول) لمدة 5-10 ثانية.
6. نغسل جيدا" في مياه الصنبورحتى تعود العينة زرقاء مجددا" (10-15 دقيقة), أو
7. التزريق من خلال الغمس في محلول قلوي ( ماء الأمونيا ) تتبع بالغسل 5دقائق في مياه الصنبور.
8. التلوين ب1% أيوزين مصفر ل10 دقائق .
9. الغسل في مياه الصنبور الجارية 1-5 دقائق .
10. نزع الماء باستعمال الكحولات.
النتائج:
النواة أزرق \ أسود
السيتوبلاسم درجات مختلفة من الزهري
ألياف العضلات زهري غامق \ أحمر
خلايا الدم الحمراء برتقالي \ أحمر
الفيبرين زهري غامق
التلوين السريع بالهيماتوكسيلين و الأيوزين من أجل الشرائح المجمدة:
1. جمد بلوك العينة النسيجية.
2. اقطع الشرائح المجمدة بسماكة 3- 6 ميكرون.
3. ثبت الشريحة بالفورمالين10% بدرجة حرارة الغرفة لعشرين ثانية.
4. اغسل بماء الصنبور.
5. لون بمحلول هيماتوكسيلين كراتزي مضاعف القوة لمدة 1دقيقة.
6. اغسل جيدا" بماء الصنبور ل 10-20 ثانية.
7. لون ب 1% أيوزين مائي ل 10 ثانية .
8. اغسل بماء الصنبور.
9. انزع الماء .
الجمعة 30 أكتوبر 2009, 3:57 am